步驟

1. 準備下列試劑和材料：

60 mm MEF 滋養(yǎng)板（接種不能超過 7 天）

帶棉塞無菌巴斯德吸管

無 Ca2+ 和 Mg2+ PBS

ES 生長培養(yǎng)基

胰酶溶液

2. PBS 沖洗 ES 細胞，巴斯德吸管加胰酶溶液覆蓋培養(yǎng)皿底（2 ml/p60）

3. 37℃ 孵育 5 分鐘左右，至細胞脫落。

4. 巴斯德吸管輕輕吹吸胰酶處理細胞 4~6 次，分散 ES 細胞。分散的細胞，包括單細胞和小的細胞團，轉移至裝有 2 ml 預熱（37℃）ES 生長培養(yǎng)基的 15 ml 離心管。

5. 離心收集細胞。吸掉上清，留約兩倍于細胞沉淀的體積。輕彈離心管懸浮細胞。加 10 ml ES 生長培養(yǎng)基，吹吸至懸液均勻。

6. 計數細胞。由于 ES 細胞較 MEF 細胞小，呈圓形，二者很容易區(qū)分。

7. ES 細胞接種 60 mm MEF 滋養(yǎng)板。吸掉 MEF 滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)基，加入懸于 5 ml ES 生長培養(yǎng)基的 ES 細胞。

8. 每天換一次液，加 5 ml ES 生長培養(yǎng)基。